原核表達中目的蛋白不明確不知是不是想要的目的條帶

2016-11-28技術資料

原核表達中目的蛋白不明確

原核表達中目的蛋白不明確不知是不是想要的目的條帶

初做蛋白表達,目的片段確定插入載體測序正確,用的BL21為宿主菌,嚐試了各種條件,比如IPTG濃度有0.1mM、0.5mM、1mM,溫度有37,30,25,蛋白電泳結果分析均無明顯目的條帶,雖在Marker相近位置處有條帶表達,但未誘導前也有該條帶的表達,且誘導後條帶濃度的增加量並不是十分明顯,所以很糾結到底是不是想要的目的條帶。
請問各位大蝦,碰到這種情況,要怎麽辦?我的蛋白帶了His標簽,如果我做鎳柱純化的話可否驗證條帶的正確性,我怕如果那條條帶就算是目的條帶的話,表達量太少我一純化損失太多也看不到,求助我該如何處理?

首先必須確認外源基因已經連接到載體且讀碼框正確,在此基礎上如果沒有表達,轉其他宿主試試。


已確認外源基因轉入載體且測序正確,現在不確定的是外源基因有沒有表達,因為條帶不明顯,像是又不像是目的條帶,所以想通過純化看一下,就是怕本來表達量少再一純化就沒了,也鑒別不了到底是不是要表達的條帶了。

是不是插入的位點不行,有可能插入的位點不合適造成讀碼框變化

推薦一個方法,你用低濃度咪唑破碎,然後取1毫升上清,加入50微升鎳柱膠(掛好鎳了的),混合幾分鍾,然後離心,去上清,留下的膠直接跑電泳,這樣微量的表達也能檢測出來。

這個方法非常的棒!!

打算按這種方法試一下,還想請教一下低濃度咪唑破碎液具體成分是什麽?做蛋白表達沒多久,每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。還有留下的膠是直接用上樣緩衝液混勻跑電泳吧?
再次感謝大蝦相助!

western blot檢測一下就行了……